2014年度的基因組生物學(xué)大會(huì )（The Biology Of Genomes）于5月6日晚在美國紐約冷泉港實(shí)驗室召開(kāi)。這是基因組學(xué)領(lǐng)域最重要的會(huì )議之一，吸引了多個(gè)著(zhù)名研究所的科學(xué)家參加。此次大會(huì )的議題包括轉化基因組學(xué)與遺傳學(xué)、復雜性狀的遺傳學(xué)、癌癥與藥物基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、計算基因組學(xué)等。

    Broad研究院的博士后研究人員Neville Sanjana在會(huì )議上介紹，他們利用CRISPR-Cas9介導的全基因組篩查，能夠鑒定出與皮膚癌治療耐藥性相關(guān)的基因。

    在CRISPR-Cas9系統中，Cas9核酸酶在DNA位點(diǎn)上產(chǎn)生雙鏈斷裂，而這一位點(diǎn)是由短的向導RNA（sgRNA）決定的。這些斷裂引入移碼突變，產(chǎn)生功能喪失的等位基因。其他的基因組改造方法依賴(lài)蛋白質(zhì)改造，而CRISPR-Cas9只需要一段短的RNA。因此，Sanjana認為，可編程性有了很大的飛躍。

    在這項研究中，Sanjana及其同事利用慢病毒在靶細胞中導入Cas9、sgRNA和選擇標記。他們還開(kāi)發(fā)出基因組規模的CRISPR敲除庫，稱(chēng)之為GeCKO。這個(gè)庫中包含近65,000個(gè)向導序列，靶定約18,000個(gè)基因。

    在檢驗GeCKO庫時(shí)，研究人員關(guān)注了兩種細胞系（A375癌細胞系和HUES62干細胞系）中對細胞活力至關(guān)重要的基因。兩個(gè)星期后的深度測序表明，存活細胞中的sgRNA多樣性大大降低，而許多被去除的sgRNA靶定核糖體結構成分及其他必需基因。這一研究成果已在《Science》上發(fā)表。

    之后，Sanjana及其同事將這種方法應用于黑色素瘤模型，以搜索與治療耐藥性相關(guān)的基因。他指出，在超過(guò)半數的黑色素瘤病例中，蛋白激酶BRAF發(fā)生突變，這個(gè)激酶調控MAPK信號級聯(lián)，而大約70%的突變是V600E突變。BRAF抑制劑vemurafenib可靶定此突變，然而超過(guò)一半的患者最初對這種療法有響應，但逐漸形成耐藥性。

    為了找到逃避突變的基因，Sanjana及其同事將GeCKO庫應用在黑色素瘤A375細胞系上。他們使用DMSO或藥物治療此細胞系，并在14天后搜索讓細胞耐受治療的變異。他們發(fā)現了之前與耐藥性相關(guān)聯(lián)的基因NF1和MED12，以及新的基因NF2、CUL3、TADA2B和TADA1。Sanjana認為，這種篩查將為癌癥研究人員帶來(lái)新的線(xiàn)索。

    Sanjana還指出，他和他的同事們正在完善這種慢病毒CRISPR工具以及全基因組篩查庫，預計本月晚些時(shí)候就可在A(yíng)ddgene中提供。Addgene是一個(gè)全球科學(xué)家共享質(zhì)粒的非盈利組織。